足利高氏为了消灭北条氏而站到后醍醐天皇一边，以其对“中兴”的大功获得天皇赐名“尊”(天皇名“尊治”之一字)的荣誉，遂将“高氏”改称“尊氏”。但是他的内心总是以镰仓幕府的继承人自居，一直在冷静地注视着一切，悄悄地积蓄着实力，伺机起事。建武2年(公元1335年)7月，北条高时之子时行攻下镰仓。8月初，尊氏未经天皇任命便自封为征东将军，率军东征。当他打败时行军队后，便宣布反对“中兴”政权。次年1月尊氏攻入京都；但旋被逐出，驰往九州，在那里得到九州、中国、四国等地武士的支援，回师再攻京都。这时站在天皇方面的武士已经不多，对天皇政权感到失望的畿内“恶党”们也不再受楠木正成的驱使。是年5月，滨川(兵库县境内)会战中尊氏大败新田义贞和柿木正成的联军、迫正成自杀，随即攻克京都。“建武中兴”至此天折。
图 足利高氏
同年尊氏在京都另立一位天皇——光明天皇(公元1336年—公元1348年在位)，被幽禁的后醍醐天皇伺机逃到大和的吉野，建立政权，自称正统(南朝)。于是出现南北两个对立的朝廷，日本史上称之为“南北朝”(公元1331年—公元1392年)。延元3年(北朝历应元年，公元1338年)尊氏从北朝天皇那里获得征夷大将军称号，在京都建立了足利幕府(后改称室町幕府)。
足利幕府的统治机构同镰仓幕府颇相类似，但尊氏的理想不是北条氏的执权政治，而是源赖朝的将军政治。在将军之下设有辅政机关“执事”(公元1362年年改称“管领”)，其地位相当于镰仓时代的“执权”，但无“执权”实权，实际等于将军的秘书长。“执事”下设“侍所”、“政所”和“问注所”，这三所除“侍所”外，其权限较镰仓时代大为缩小。还恢复了“评定众”与“引付众”，但已形同虚设。所有这些机关的具体事务都由各“奉行”处理。作为地方机构，尊氏在要地镰仓设“镰仓府”，在奥羽置“奥州探题”(后又置“羽州探题”)，在九州置“镇西探题”。“镰仓府”辖10国(关东8国，加上甲斐、伊豆2国)，下设机构一“如幕府，故向有小幕府之称。其长官初称“关东管领”，后改称“关东公方”，尊氏嫡子义拴首任其职，后由其弟基氏取代，足利姻戚上杉氏任“执事”(后改称“关东管领”)辅佐。此外各国置守护，按北条先例，将细川、今川等足利氏一族武将安插在要国，作将军支柱。守护不限一人一国，有不少兼任数国守护之职。
足利尊氏效法源赖朝、北条泰时实行政治革新。他在继续沿用 镰仓武家法典《贞永式目》的同时，结合当时形势。，按“量时设制”原则制成新法典《建武式目》17条，作为足利幕府开创期的基本施政方针。《建武式目》总结了镰仓幕府和中国自周秦迄隋唐历代封建统治的历史经验，禁止官吏贪污行贿、奢侈腐化，提倡节俭；规定用人要精选，使称职者出任官吏，尤其是各国守护；还禁止权贵和僧侣插手政界。
为实现国家统一，尊氏不断发动对吉野朝廷的军事攻势。南朝方面宿将北田显家、新田义贞等相继死去，延元4年(北朝历应2年，公元1339年)后醍醐天皇在建立南朝3年之后亦病死。随后的时期，幕内统治集团内部分裂，幕府实力削弱。尊氏支持急进派高师直(?—公元1351年)反对保守派足利直义(尊氏之弟)，正平6年(北朝观应2年，公元1351年)高师直战死后又同直义斗争，次年消灭直义，斗争基本获胜。然而南朝由于得到直义党羽的支持又重整旗鼓，两度攻入京都。正平10年(北朝文和4年公元1355年)尊氏扭转了局势，取得决定性胜利，为最后消灭南朝政权、实现全国统一奠定了基础。不久尊氏死去(公元1358年)。